黃曲霉毒素的分析方法從最初以薄層層析法為主，發(fā)展到高效液相色譜法、微柱法、酶聯(lián)免疫吸附法等多種普遍應(yīng)用，其進(jìn)展與新的化學(xué)檢測(cè)手段和新儀器的出現(xiàn)密不可分。這些新方法、新手段的快速應(yīng)用，為黃曲霉毒素的檢測(cè)分析提供了更廣泛的選擇余地，適應(yīng)了不同的檢測(cè)目的和要求。
2.1薄層色譜法(TLC)TLC法是測(cè)定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法,是我國(guó)測(cè)定食品及飼料中AFTB1的標(biāo)準(zhǔn)方法之一(GB/T5009.23—1996)[9]。其原理是樣品經(jīng)過(guò)提取、柱層析、洗脫、濃縮、薄層板展開(kāi)分離后,在365nm紫外燈下,AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別顯示紫色、藍(lán)紫色、綠色和綠色熒光。并根據(jù)其在薄層上顯示的最低檢出量來(lái)確定其含量。TLC有單向展開(kāi)法和雙向展開(kāi)法,其中雙向展開(kāi)法能進(jìn)一步除去樣品中的雜質(zhì),提高靈敏度。TLC法由于設(shè)備簡(jiǎn)單,易于普及,所以國(guó)內(nèi)外仍在使用,但由于該法樣品前處理繁瑣,且提取和凈化效果不夠理想,提取液中雜質(zhì)較多,因而在展開(kāi)時(shí)影響斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,雙向展開(kāi)法雖避免了雜質(zhì)干擾,但增加了操作步驟和時(shí)間。TLC法較適合于對(duì)黃曲霉毒素的定性檢測(cè),是研究黃曲霉毒素初期所使用的主要方法。
該檢測(cè)方法所用設(shè)備簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、容易掌握,適用大量樣品的分離、篩選,一般的實(shí)驗(yàn)室均可開(kāi)展,屬于定性和半定量檢測(cè)。TLC有單向展開(kāi)和雙向展開(kāi)法,其中雙向展開(kāi)法能進(jìn)一步除去樣品中的雜質(zhì),提高靈敏度,省略了柱層析等凈操作步驟。TLC法由于設(shè)備簡(jiǎn)單,一般實(shí)驗(yàn)室都能滿足,利于普及,仍是現(xiàn)在檢測(cè)AFT的主要方法之一。Stroka[10]開(kāi)發(fā)出的光度檢測(cè)器在檢測(cè)AFT時(shí),最低限可以檢測(cè)到1ng。Otta等在TLC上結(jié)合光度計(jì),不僅能把樣品提純,而且也能同時(shí)1次對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)[11]。江湖等利用HPTLC檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中的AFT,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的檢出限達(dá)0.8、0.4、0.7、0.4μg/kg[12]。王宏亮對(duì)國(guó)際(3B/T5009·22-1996)所規(guī)定的方法進(jìn)行了部分改進(jìn)，在利用CCl4抽提前，加人質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的醋酸鉛溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaCl溶液，再用CCl4振動(dòng)抽提，于薄層板點(diǎn)樣后展開(kāi)時(shí)，先用CCl4丙酮的混合液正向展開(kāi)，然后用無(wú)水乙醚進(jìn)行反向展開(kāi)，回收率為76.9%，最低檢出限量為5×l0-9，改進(jìn)后的方法進(jìn)一步排除了蛋白質(zhì)雜質(zhì)，使提取與凈化效果增強(qiáng)，在薄層雙向展開(kāi)時(shí)組分分離也更安全，AFTB1形成的斑點(diǎn)易觀察，操作簡(jiǎn)便，但增加了操作步驟[13]。化學(xué)對(duì)照品
2.2高效液相色譜法(HPLC)HPLC是近幾年發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)AFTB1方法,主要是用熒光檢測(cè)器檢測(cè),在適宜的流動(dòng)相條件下,采用反相C18柱,使多種黃曲霉毒素同時(shí)分離。高效液相色譜法靈敏、分辨率高,可作定性、定量分析,同時(shí)可檢測(cè)多個(gè)黃曲霉毒素種類,適于大批量樣品的分析。
宋歡采用佛羅里硅土凈化柱凈化，三氟乙酸柱前衍生檢測(cè)飼料中AFTB1，回收率為83%，相關(guān)系數(shù)r=0.9998[14]。李佐卿等則將免疫學(xué)技術(shù)和HPLC法相結(jié)合,采用免疫親和柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化,AFTB1回收率達(dá)到97.3%,相關(guān)系數(shù)r=0.9994,最低檢出限為6.25pg,該法將提取、凈化、濃縮一次完成,大大簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程,提高了工作效率及方法的靈敏度,但增加了成本[15]。文鏡采用國(guó)產(chǎn)硅鎂吸附柱層析分離純化玉米中AFTB1,用HPLC法檢測(cè),方法簡(jiǎn)便,純化效果好,最低檢出量為0.08ng,回收率為92.87%,該法制柱方便,而且降低了成本[16]。
高效液相色譜法儀器設(shè)備昂貴,技術(shù)水平要求高,每次實(shí)驗(yàn)所使用的化學(xué)藥劑和處理途徑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響程度差別很大,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精度造成影響；樣品還需進(jìn)行繁瑣的純化處理,不適合快速檢測(cè)。
2.3微柱法：微柱篩選法是將樣品提取液通過(guò)由氧化鋁與硅鎂吸附劑組成的微柱層析管,雜質(zhì)被氧化鋁吸附,黃曲霉毒素被硅鎂吸附劑吸附,在365nm紫外線下呈藍(lán)紫色熒光,其熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)與黃曲霉毒素的含量成正比,由于微柱不能分離黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,故檢測(cè)結(jié)果為黃曲霉毒素的總量。
微柱篩選法測(cè)定黃曲霉毒素,主要是用來(lái)檢驗(yàn)黃曲霉毒素的存在與否以及快速篩選出超標(biāo)樣品。要對(duì)黃曲霉毒素種類進(jìn)行區(qū)分定量檢驗(yàn),則需要對(duì)不同黃曲霉毒素組分進(jìn)行分離,再利用其它方法檢測(cè)。因此,微柱篩選法并不能完成整個(gè)黃曲霉毒素的檢測(cè)過(guò)程,僅適用于定性檢驗(yàn)。陳達(dá)民通過(guò)微柱法測(cè)定黃曲霉毒素,樣品經(jīng)前處理后，即在365nm紫外光下觀察結(jié)果，有微黃色熒光出現(xiàn)，則樣品不含黃曲霉毒素，若藍(lán)紫色熒光出現(xiàn)，則為陽(yáng)性檢出，再根據(jù)其熒光強(qiáng)度與事先已知含量的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)管相比較確定其含量。
2.4免疫化學(xué)法：免疫化學(xué)法是根據(jù)免疫學(xué)抗原抗體高特異性結(jié)合,設(shè)計(jì)并發(fā)展起來(lái)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)[18]。具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、特異性強(qiáng)、時(shí)間短、檢測(cè)限低等特點(diǎn),同時(shí)又能減少有害試劑的使用,對(duì)檢測(cè)人員健康起一定保護(hù)作用,在AFT檢測(cè)方面取得了很大的應(yīng)用。具有代表性的主要有免疫層析法(IICA)、放射免疫分析方法(RIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等,它們均可以進(jìn)行定量測(cè)定。
2.4.1免疫親和柱熒光光度法(IAC)：IAC是美國(guó)公職化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)檢測(cè)AFT的標(biāo)準(zhǔn)方法。其原理是利用單克隆免疫親和柱為分離手段,將單克隆抗體與載體蛋白成功偶聯(lián),偶聯(lián)物填柱形成IAC,并與AFT半抗原產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的特異性吸附關(guān)系。當(dāng)樣品通過(guò)柱子時(shí),因抗原只能吸附相應(yīng)的抗體,所以IAC也就只能吸附AFT,別的雜質(zhì)因不被吸附而流出柱子。IAC的優(yōu)點(diǎn)是在檢測(cè)過(guò)程中,檢測(cè)人員不用直接接觸AFT,并接觸很少試劑就完成整個(gè)檢測(cè)。操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、靈敏度高且能直接讀數(shù),所以應(yīng)用范圍很廣。局限性是不能單獨(dú)測(cè)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2,只能測(cè)AFT總量,同時(shí)對(duì)試劑要求也較高,如檢測(cè)過(guò)程中所有用到的水必須是雙蒸水,而所用的容器也必須用雙蒸水洗滌。中藥對(duì)照品
2.4.2免疫親和柱凈化熒光光度法(SFB)：SFB是新發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)AFT的方法,其設(shè)備輕便、自動(dòng)化高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏、時(shí)間短,廣泛應(yīng)用于檢測(cè)日常飼料中的AFT是否超標(biāo)。國(guó)外Vicam公司開(kāi)發(fā)出的V2系列型熒光光度計(jì),可以直接讀取AFT的總量。但用SFB法檢測(cè)中藥材中AFT的含量時(shí),結(jié)果中出現(xiàn)很多假陽(yáng)性,造成結(jié)果不準(zhǔn)確。王晶等用SFB法快速檢測(cè)日常食用醬油和醋樣品中AFT含量,其檢出限分別是2·5μg/kg和1μg/kg,添加回收率在85%以上
2.4.3酶聯(lián)吸附法(ELISA)ELISA是利用免疫、酶和生化技術(shù)來(lái)檢測(cè)AFT。ELISA是上世紀(jì)70年代出現(xiàn)的新的免疫技術(shù)[21],最初由荷蘭學(xué)者anWeeman和瑞典學(xué)者Engvall與Perlman幾乎同時(shí)提出,主要用于病毒的檢測(cè),70年代中后期開(kāi)始用于真菌毒素的檢測(cè)。ELISA以其簡(jiǎn)便、快速、靈敏、成本低、檢測(cè)譜廣等特點(diǎn)在檢測(cè)方面越來(lái)越受到人們的青睞,是一種定性或半定量的方法。
ELISA的基本原理是首先將抗原或抗體固化。吸附在固相載體表面的抗原或抗體,仍然保持著其免疫學(xué)活性。其次是酶標(biāo)記,被固定的抗原或抗體以共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物,而此物仍保持著免疫學(xué)和酶學(xué)活性。三是顯色反應(yīng),酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng),再加入底物顯色液,來(lái)判定反應(yīng)是否進(jìn)行,顏色的深淺和免疫反應(yīng)成比例的關(guān)系。所以通過(guò)顯色可以判斷反應(yīng)是否進(jìn)行,而通過(guò)后面的測(cè)定,又可以進(jìn)行半定量檢測(cè)。ELISA主要分為直接法測(cè)定抗原、間接法測(cè)定抗體[23,24]、雙抗體夾心法測(cè)定抗原、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原。
2.5金標(biāo)免疫層析檢測(cè)技術(shù)(GICA)GICA利用納米金作為標(biāo)記物,在很短的時(shí)間內(nèi)就能測(cè)出待測(cè)物的含量,并可以直接讀取結(jié)果。不需要分離純化樣品,也無(wú)需對(duì)檢測(cè)溶劑做任何的處理,真正做到一步檢測(cè),方便、高效。Zhang等通過(guò)此方法分析一個(gè)樣品,用時(shí)不到10min,非常高效[26]。在金標(biāo)免疫試紙法的應(yīng)用過(guò)程中,孫秀蘭等研究了樣品基質(zhì)對(duì)試紙條信號(hào)靈敏度的影響,并為消除這些影響提供了經(jīng)驗(yàn)。在檢測(cè)樣品中對(duì)粗提取液用氯仿法萃取后,使其揮干再溶解,可將鹽離子和重金屬離子對(duì)測(cè)定的影響控制在允許范圍之內(nèi);用石油醚脫脂,可將油脂對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響降到最低[27]。鄧省亮等用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,標(biāo)記抗AFB1單克隆抗體并噴于玻璃纖維上,AFB1偶聯(lián)抗原和二抗分別結(jié)合于硝酸纖維膜上,依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維膜和吸水紙組裝切割成膠體金試紙條并裝入檢測(cè)卡中。測(cè)試結(jié)果表明,AFB1快速檢測(cè)試紙條的靈敏度為5ng/mL,檢測(cè)時(shí)間為10min,批內(nèi)和批間重復(fù)性100%,假陽(yáng)性率和假陰性率均為0。
| 名稱 |
cas號(hào) |
中英文別名 |
點(diǎn)擊查看價(jià)格 |
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| 黃曲霉素B2 |
7220-81-7 |
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| 黃曲霉素B1 |
1162-65-8 |
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| 黃曲霉素G1 |
1165-39-5 |
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| 黃曲霉素M2 |
6885-57-0 |
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| 黃曲霉毒素M1 |
6795-23-9 |
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| 黃曲霉毒素G2 |
7241-98-7 |
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黃曲霉素G2 (7aR,10aS)-3,4,7a,9,10,10a-Hexahydro-5-methoxy-1H,12H-furo[3?,2?:4,5]furo[2,3-h]pyrano[3,4-c][1]benzopyran-1,12-dione; Dihydroaflatoxin G1;
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