桿菌肽的危害及檢測目的
桿菌肽是由一組類似的多肽成分組成的混合物，其中桿菌肽A、B1和B2組分被認(rèn)為最具抗微生物活性。獸醫(yī)臨床上常見以桿菌肽鋅和桿菌肽亞甲基水楊酸鹽形式用于畜禽促生長和防治動物的壞死性腸炎。在歐盟，亞甲基水楊酸桿菌肽還被推薦用于治療由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的兔壞死性腸炎。桿菌肽抗菌譜廣、吸收低，但會帶來神經(jīng)毒性和腎毒性，還會產(chǎn)生抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，是治療中使用普通抗生素?zé)o效的最后選擇。若該類抗生素通過食物鏈進(jìn)入人體，會對人體造成健康隱患。因此我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和國家市場監(jiān)督管理總局2019年發(fā)布的GB 31650-2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了桿菌肽在動物靶組織中的殘留限量。
本文闡述了如何將桿菌肽從樣品基質(zhì)中分離提取出來，并經(jīng)過凈化后，轉(zhuǎn)化成液質(zhì)聯(lián)用儀可以檢測的形式。以提取、凈化為重點(diǎn)，依據(jù)國標(biāo)GB/T 20743-2006，為檢測人員和相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供一定的參考。
檢測項(xiàng)目：桿菌肽
應(yīng)用范圍：豬肉、豬肝和豬腎
液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法
方法原理：試樣中桿菌肽殘留用酸化的甲醇水勻漿提取，經(jīng)雙硫腙三氯甲烷溶液進(jìn)行液液分配凈化后，再經(jīng)固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。
前處理儀器：
分析天平（感量0.01 g 和0.1 mg）；高速組織搗碎機(jī)（10000 r/min）；振蕩器；離心機(jī)（4000 r/min）；離心管（10 mL和60 mL具塞）；貯液器（50 mL）；固相萃取真空裝置；氮吹儀；微量注射器（25 μL和100 μL）。
檢測儀器：LC-MS/MS+ESI源
樣品的制備與保存
豬肝臟、腎臟要去除脂肪和其他的非肝臟、腎臟組織，豬肉要去皮和骨頭，將其攪碎拌勻，分出0.5 kg作為試樣，將制備好的試樣密封，并做上標(biāo)記。試樣置于零下18 ℃條件下保存。
前處理方法
1.提取
稱取10 g試樣（精確到0.01 g ）置于60 mL離心管中，加入0.1 mL甲酸和20 mL甲醇+水（1+1），于高速組織搗碎機(jī)上勻漿提取1 min，然后加入20 mL經(jīng)甲醇+水（1+1）飽和的0.0025 %雙硫腙三氯甲烷溶液，于振蕩器上劇烈振蕩10 min，以4000 r/min離心10 min，取上清液10 mL于50 mL試管中，棄去其余上清液。
往上述雙硫腙三氯甲烷溶液中加入30 mL水，搗碎殘?jiān)糜谡袷幤魃蟿×艺袷?0 min，移取全部上清液于另一60 mL離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液，混勻，以4000 r/min離心10 min，取上清液30 mL與50 mL試管中的提取液合并，混勻。
2.凈化
在預(yù)處理過的固相萃取柱（HLB 60 mg/3 mL用3 mL甲醇和3 mL水活化）頂部連接貯液器，移入上述試管中樣液，待樣液全部通過萃取柱后，加入2 mL水，棄去全部流出液。然后，將固相萃取柱在50 kPa～55 kPa的負(fù)壓下抽干1 h，最后用2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL試管中，洗脫液在35 ℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑?.5 mL甲醇重新溶解殘?jiān)偌尤?.5 mL 0.3 %甲酸溶液，搖勻后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
國標(biāo)解讀及注意事項(xiàng)
1.桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用0.1 %甲酸甲醇溶液配成濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在2 ℃～4 ℃保存，有效期3個(gè)月。
2.本方法使用酸化甲醇水均質(zhì)提取，經(jīng)雙硫腙三氯甲烷液液分配凈化后，再用HLB固相萃取柱凈化，相當(dāng)于5 g樣品進(jìn)行上機(jī)檢測。
3.桿菌肽易溶于水，在弱酸性條件下穩(wěn)定，有機(jī)相越高回收率越低，使用酸化甲醇水（1+1）提取回收率高但是容易乳化，使用雙硫腙三氯甲烷進(jìn)行液液分配凈化，離心后可降低乳化程度，使上清液更加清澈。
4.通過兩次水洗雙硫腙三氯甲烷殘?jiān)粌H可提高目標(biāo)物的回收率，確保稀釋倍數(shù)準(zhǔn)確，還可以在合并上清液后降低甲醇比例，為下一步固相萃取凈化做好準(zhǔn)備。
5.固相萃取過程中需要控制流速，使溶液一滴一滴地流下，以保證凈化富集的效果。
6.本方法使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行定量分析，根據(jù)具體檢測樣品選取合適的基質(zhì)制作空白樣品提取液配制基質(zhì)曲線。