多年來(lái)，寡核苷酸的合成方法發(fā)展歷程：，從 Michelson和Todd 早期的H-膦酸酯和磷酸三酯法[1]，以及Khorana在 1950 年代的磷酸二酯法[2]，再到1960年代磷酸三酯法的重新研究和1970年代的亞磷酸三酯法[3]。這些方法中的每一種都存在其弊端。亞磷酰胺法由Marvin Caruthers在1980年代初期開(kāi)創(chuàng)，并通過(guò)固相技術(shù)和自動(dòng)化的應(yīng)用得到加強(qiáng)，現(xiàn)已成為首選方法。
亞磷酰胺法
亞磷酰胺寡核苷酸的合成沿3'至5'方向進(jìn)行（與DNA 復(fù)制中生物合成的5'至3'方向相反）。每個(gè)合成周期添加一個(gè)核苷酸[4]。
圖1.亞磷酰胺寡核苷酸合成循環(huán)
DNA合成的亞磷酰胺單體主要由堿基、脫氧核糖、5'端的DMT和3'端的2-氰乙基以及二異丙基胺基組成。此外，由于腺嘌呤、胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤和一些人工堿基存在伯氨基，因此也需要在單元中用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)對(duì)其保護(hù)。在寡核苷酸合成之前必須從載體結(jié)合的核苷中脫去DMT保護(hù)基團(tuán)。
步驟1：活化和偶聯(lián)
在進(jìn)行偶聯(lián)之前，活化劑四唑提供一個(gè)質(zhì)子給亞磷酰胺單體3'磷酸上二異丙胺基的氮原子，質(zhì)子化的二異丙胺是一個(gè)良好的離去基團(tuán)，與四唑形成亞磷酰胺四唑這種活性中間體，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為活化。脫保護(hù)的5'端-OH會(huì)與亞磷酰胺四唑活性中間體偶聯(lián)，形成新的磷氧鍵，并脫去四唑。在這一步核苷酸鏈得到延伸，需要注意的是：?jiǎn)误w及活化劑中水分超標(biāo)導(dǎo)致偶聯(lián)效率低，原料中雜質(zhì)較多也會(huì)導(dǎo)致偶聯(lián)效率低。
圖2.亞磷酰胺偶聯(lián)反應(yīng)機(jī)理
核苷亞磷酰胺在惰性氣體氛圍中相當(dāng)穩(wěn)定，可以用于制備與運(yùn)輸，并可以在使用前以干燥固體形式儲(chǔ)存數(shù)月。只有在質(zhì)子化作用時(shí)，核苷亞磷酰胺才具有反應(yīng)性。
步驟2：加帽
在每個(gè)偶聯(lián)步驟中使用大大過(guò)量的四唑和亞磷酰胺單體可以將每一步偶聯(lián)的效率提高到99.5%以上，但即使使用最有效的化學(xué)方法和純度最高的試劑，也不可能實(shí)現(xiàn)100%的核苷都參與反應(yīng)。這意味著核苷酸上會(huì)有一些未反應(yīng)的 5'-羥基；如果不加以控制，這些 5'-羥基將可用于參與下一個(gè)偶聯(lián)步驟，并與引入的亞磷酰胺反應(yīng)，導(dǎo)致得到的寡核苷酸會(huì)缺少一個(gè)堿基，并且對(duì)應(yīng)于所需寡核苷酸的缺失突變。如果不檢查這種缺失突變，它們會(huì)隨著每個(gè)連續(xù)的循環(huán)而累積，最終產(chǎn)物將是寡核苷酸的復(fù)雜混合物，其中大部分將攜帶不正確的遺傳信息，并且難以純化。這還會(huì)導(dǎo)致后續(xù)生化實(shí)驗(yàn)的失敗。
圖3.正確寡核苷酸的缺失突變序列（上）；和一個(gè)包含缺失突變的失敗序列（下），對(duì)應(yīng)于第 6 位胸腺嘧啶堿基的缺失。
通過(guò)在偶聯(lián)反應(yīng)后引入“加帽”步驟來(lái)避免缺失突變，以阻斷未反應(yīng)的5'端-OH。合成器上使用了兩種封端溶液：乙酸酐和N-甲基咪唑 (NMI)。這兩種試劑（溶解在四氫呋喃中并添加少量吡啶）在輸送到合成柱之前在 DNA 合成儀混合。親電子混合物快速乙酰化，吡啶確保 pH 值保持堿性，以防止由乙酸酐與 NMI 反應(yīng)形成的乙酸對(duì)核苷亞磷酰胺進(jìn)行脫保護(hù)。 5'端-OH的乙酰化即可使它們對(duì)隨后的反應(yīng)呈惰性。
圖4.亞磷酰胺寡核苷酸合成中加帽步驟的機(jī)理
步驟3：氧化
偶聯(lián)反應(yīng)后新加上的核苷酸通過(guò)亞磷酯鍵（磷為三價(jià)）與寡核苷酸鏈相連，此亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，因此需將此處三價(jià)磷氧化為五價(jià)的磷。被氧化后形成的磷酸二酯鍵實(shí)際上就是DNA鏈中的磷酸二酯鍵外加一個(gè)2-氰乙基保護(hù)，該保護(hù)基可以使磷酸二酯鍵在后續(xù)的合成中更穩(wěn)定。這一步常用的氧化劑為碘的四氫呋喃溶液，此步反應(yīng)速度亦很快。
圖5.亞磷酰胺寡核苷酸合成中氧化步驟的機(jī)理
在一些 DNA 合成儀上，碘氧化后還有第二個(gè)加帽步驟。這樣做的目的是干燥磷酸酯，因?yàn)檠趸旌衔镏械臍埩羲畷?huì)持續(xù)存在并抑制下一次偶聯(lián)反應(yīng)。過(guò)量的水與酰化劑反應(yīng)形成乙酸，該乙酸會(huì)在THF/吡啶溶劑混合物中被除去。
步驟4：脫保護(hù)
在磷酰胺偶聯(lián)、封端和氧化后，必須脫去核苷酸5'端的DMT保護(hù)基，以便伯羥基可以與下一個(gè)核苷酸亞磷酰胺進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。在二氯甲烷中用三氯乙酸脫保護(hù)是快速且定量的。注意太濃縮的TCA溶液或太長(zhǎng)的脫三苯甲基化時(shí)間會(huì)導(dǎo)致脫嘌呤，因而會(huì)降低最終寡核苷酸的總產(chǎn)率。裂解產(chǎn)生的DMT碳陽(yáng)離子顯示橙色，它在495nm處有可見(jiàn)光吸收，可通過(guò)檢測(cè)其吸光度監(jiān)測(cè)偶聯(lián)效率。
這一步結(jié)束后，延伸后的寡核苷酸鏈進(jìn)入下一循環(huán)，然后不斷重復(fù)循環(huán)直至鏈延伸至所需長(zhǎng)度。
參考文獻(xiàn)：
1. A. M. Michelson,Alexander R. Todd. Nucleotides part XXXII. Synthesis of a dithymidine dinucleotide containing a 3′: 5′-internucleotidic linkage[J]. Journal of the Chemical Society (Resumed),1955,0(0). https://doi.org/10.1039/JR9550002632
2. P. T. Gilham,H. G. Khorana. Studies on Polynucleotides. I. A New and General Method for the Chemical Synthesis of the C5’-C3’ Internucleotidic Linkage. Syntheses of Deoxyribo-dinucleotides1[J]. J. Am. Che m. Soc.,2002,80(23). https://doi.org/10.1021/ja01556a016
3. Reese Colin B..The chemical synthesis of oligo-and poly-nucleotides by the phosphotriester approach[J]. Tetrahedron,1978,34(21). https://doi.org/10.1016/0040-4020(78)87013-6
4. 4.Beaucage S.L.,Caruthers M.H.. Deoxynucleoside phosphoramidites
--A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis[J]. Tetrahedron Letters,1981,22(20). https://doi.org/ 10.1016/S0040-4039(01)90461-7